DNA-vicrivelado: Malsamoj inter versioj

 

Ĉiufoje ke ddNTP estas enkorpigita ĉe iu pozicio, la faden-plilongiĝado haltas ĉe tiu punkto kaj tiel estiĝas aro da molekuloj kun malsamaj longecoj, sed ĉiuj finiĝantaj per la sama ddNTP por unu aparta tubo. Se la dNTP kaj la ddNTP korespondanta aldoniĝas je adekvataj kvantoj, ĉiuj DNA-fragmentoj ĵuse sintezitaj kaj finiĝantaj per tiu ddNTP estos reprezentitaj. La enhavo de la 4 tuboj A, C, T kaj G estas sekve analizita per [[elektroforezo]] en akrilamida ĝelo je denaturigaj kondiĉoj (aŭ per har-dika elektroforezilo). La nove sintezitaj diversaj markitaj fragmentoj migras laŭ sia longeco kaj disiĝas laŭ sia nukleotid-nombro. Memradiografio (se uzo de radioaktive markitaj nukleotidoj) aŭ rivelo per fluoresko (se uzo de fluoreskaj nukleotidoj) estas realigita post migrado de la molekuloj en la ĝelo. La sinsekvo 5'-P->3'-OH de la nove sintezita fadeno legiĝas de malsupre supren, komparante la relativajn poziciojn de la bandoj en la 4 migrotrakoj.

==Aŭtomata vicrivelado==

 

 

===Fluoreska prajmilo===

 

En la metodo tiel nomita '''fluoreska prajmilo''' la uzita prajmilo en la vicrivela reakcio estas markita per fluoreskenzo. La reakcio estas farita en 4 apartaj tuboj, ĉiu enhavanta la prajmilon kuplitan kun fluoreskenzo ĉeeste de aparta korespondanta ddNTP. La DNA-polimerazo uzata por la reakcio estas termostabila kaj la polimerigado okazas en PĉR-maŝino per 3-etapaj cikloj:

 

Reakcifine, la denaturitaj DNA-fragmentoj estas disigitaj per migrigo en plur-akrilamida ĝelo aŭ en hardika elektroforeza matrico. La DNA-fragmentoj aŭtomate analiziĝas elire de la ĝelo per laser-sistemo kiu ebligas identigi la fluoreskenzon. La rezultoj estas enkomputiligitaj kaj bitprogramo ebligas elkomputi kromatografion korespondantan al la sinsekvo.

 

===Fluoreska finilo===

En la metodo tiel nomita '''fluoreska finilo''', ddNTP estas ĉiuj markitaj per specifa fluoreskenzo. Ĉio okazas laŭ la sama principo kiel pri la ''Fluoreska prajmilo''-metodo krom ke la reakcio okazas en ununura tubo. La avantaĝo de tiu metodo ''Fluoreska finilo'' estas ke oni povas uzi kiun ajn prajmilon por la vicrivela reakcio. Eblas do vicriveli longan klonitan DNA-fragmenton elektante la postan prajmilon konsiderante la reakcifinon de la antaŭa sinsekvo. Tiu metodo nun estas la plej uzata.