DNA-vicrivelado: Malsamoj inter versioj

 

== Principo ==

 

Nukleotida [[prajmilo]] estas hibridita kun la unufadena DNA-fragmento kies sinsekvon oni volas determini. Ekde la 3'-OH finaĵo de la prajmilo, [[DNA-polimerazo]] sintezas la DNA-fadenon komplementan al la DNA-matrico ĉeeste de deoksiribonukleotidoj. Unu el la deoksiribonukleotido devas esti markita (ĉu radioaktive, ĉu fluoreske). La miksaĵo estas poste kvaronigita en 4 tubojn markitajn A, C, T kaj G. Ĉiu el tiuj tuboj enhavas, krom la 4 tipojn de dNTP, la ddNTP-n kongruan (ddATP aŭ ddCTP aŭ ddGTP aŭ ddTTP). En ĉiu tubo, la aldonita ddNTP estas envicigita en la plilongiĝantajn fragmentojn.

 

Ĉiufoje ke ddNTP estas envicigita ĉe iu pozicio, la faden-plilongiĝado haltas ĉe tiu punkto kaj tiel estiĝas aro da molekuloj kun malsamaj longecoj, sed ĉiuj finiĝantaj per la sama ddNTP por unu aparta tubo. Se la dNTP kaj la kongrua ddNTP aldoniĝas je adekvataj kvantoj, ĉiuj DNA-fragmentoj ĵuse sintezitaj kaj finiĝantaj per tiu ddNTP estos reprezentitaj. La enhavo de la 4 tuboj A, C, T kaj G estas sekve analizata per [[elektroforezo]] en akrilamida ĝelo je denaturigaj kondiĉoj (aŭ per har-dika elektroforezilo). La nove sintezitaj diversaj markitaj fragmentoj migras laŭ sia longeco kaj disiĝas laŭ sia nukleotid-nombro. Memradiografio (se uzo de radioaktive markitaj nukleotidoj) aŭ rivelo per fluoresko (se uzo de fluoreskaj nukleotidoj) estas realigita post migrado de la molekuloj en la ĝelo. La sinsekvo 5'-P->3'-OH de la nove sintezita fadeno legiĝas de malsupre supren, komparante la relativajn poziciojn de la bandoj en la 4 migrotrakoj.

 

Dum tiuj analizoj, la ĝel-legado kaj daten-akirado estas aŭtomataj. Tiukaze, la molekul-markadon oni faras per fluoreskaj markiloj. Dum la ĝel-migrado, la samploj detektiĝas je ties eliro pere de lasero kiu identigas la markitan molekulon. Novaj sistemoj funkciantaj surbaze de hardika elektroforezil-uzado ebligas pli bonan aŭtomatigon de la sistemo: samploj estas preparitaj mane kaj deponitaj en aŭtomatan ŝarĝilon. La aparato aŭtomate elprenas la samplon kaj lokas ĝin en la hardikan tubon. Ne plu necesas prepari akrilamidajn ĝelojn. La aŭtomataj vicriveliloj povas ene de kelkaj horoj analizi ĝis 96 samplojn. La aŭtomatigo ankaŭ povas koncerni vicrivelan reakcion kiun oni pli kaj pli ofte faras per robotoj kuplitaj kun PĈR-maŝinoj.

 

=== Fluoreska prajmilo ===

 

En la metodo tiel nomita '''fluoreska prajmilo''' la uzita prajmilo en la vicrivela reakcio estas markita per fluoreskenzo. La reakcio estas farita en 4 apartaj tuboj, ĉiu enhavanta la prajmilon kuplitan kun fluoreskenzo ĉeeste de aparta korespondanta ddNTP. La DNA-polimerazo uzata por la reakcio estas termostabila kaj la polimerigado okazas en PĉR-maŝino per 3-etapaj cikloj:

 

Reakcifine, la denaturitaj DNA-fragmentoj estas disigitaj per migrigo en plur-akrilamida ĝelo aŭ en hardika elektroforeza matrico. La DNA-fragmentoj aŭtomate analiziĝas elire de la ĝelo per laser-sistemo kiu ebligas identigi la fluoreskenzon. La rezultoj estas enkomputiligitaj kaj bitprogramo ebligas elkomputi kromatografion korespondantan al la sinsekvo.

 

=== Fluoreska finilo ===

En la metodo tiel nomita '''fluoreska finilo''', ddNTP estas ĉiuj markitaj per specifa fluoreskenzo. Ĉio okazas laŭ la sama principo kiel pri la ''Fluoreska prajmilo''-metodo krom ke la reakcio okazas en ununura tubo. La avantaĝo de tiu metodo ''Fluoreska finilo'' estas ke oni povas uzi kiun ajn prajmilon por la vicrivela reakcio. Eblas do vicriveli longan klonitan DNA-fragmenton elektante la postan prajmilon konsiderante la reakcifinon de la antaŭa sinsekvo. Tiu metodo nun estas la plej uzata.

 

 

== Eksteraj ligiloj ==

Pri uzo de "'''enz'''" en fluoresk'''enz'''o: https://bertilow.com/pmeg/vortfarado/neoficialaj_afiksoj/sufiksoj/enz.html?a=bk