Proteina trimoo
Proteina trimoo (P-trimoo) estas uzata por detekti proteinon specifan en samplo helpe de antikorpoj specifaj al tiu proteino. Tiu tekniko ankaŭ provizas informojn pri la grandeco de la proteino.
La diversaj etapoj de proteina trimoo redakti
Elektroforeza ĝelo redakti
Elektroforeze, la proteinoj de la samplo estas disigitaj laŭ ties grandeco en ĝelo. Ĝenerale, la ĝelo enhavas plurajn putojn tiel ke estas eble analizi plurajn samplojn samtempe. Tamen, ankaŭ eblas uzi 2-Dan (2-dimensian) ĝelon ebligantan migrigi samplojn laŭ 2 dimensioj.
Transigo ĉe nitrocelulozan membranon redakti
Tiam la enĝelaj proteinoj estas transigataj ĉe nitrocelulozan aŭ PVDFan membranon, ĉu per premado aŭ per uzo de elektra kurento. Tiu procezo necesas ĉar ĝi ebligas elmontradi la proteinon al la antikorpoj. La membrano estas glua kaj ligas malspecife proteinojn al si (tio estas, ĝi ligas ĉiujn proteinojn ĉeestantajn en la samplo). La proteinoj fiksiĝas ĉe membrano dank al akvofuĝaj kaj jonaj interagoj. La PVDF-membranoj estas plej ofte uzataj pro ties fortikeco, krome ili estas purigeblaj kaj reuzotaj.
Male al tiu el nitrocelulozo, PVDF-membranojn oni povas sorbigi per metanolo aŭ izopropanolo 100%a antaŭ ol ilin uzi.
Blokado redakti
Oni blokas la membranon por malebligi ne specifajn interagojn inter la membrano kaj la antikorpoj. Oni mergas la membranon en BSA-solvaĵon (bova ser-albumino) aŭ en laktigitan solvaĵon en kiun oni verŝis polvan lakton sen grasaĵoj. Sen blokado, la antikorpoj, kiujn oni kontaktigas kun la membrano fiksiĝus sen-specife ĉie ĉe la nitrocelulozon.
Unua antikorpo redakti
La unua antikorpo estas longdaŭre kontaktigata kun la membrano. Oni ĝin diluas en solvaĵo enhavanta etan kvanton de salo tia, kia natria kloro. La solvaĵo krome enhavas proteinojn tiajn, kiaj BSA por malebligi ne specifan fiksiĝon de antikorpo ĉe la membranon kaj bufron por konservigi al la solvaĵo neŭtralan pH-n. Diluita antikorpa solvaĵo kaj la membrano estas kunigitaj en plastan sakon kaj la tuto estas dolĉe agitata por inkubacio proksima al duon-horo. La unua antikorpo rekonas kaj alfiksiĝas nur al interesa proteino. La unua antikorpo estas havigita imuniginte beston (kutime kuniklon aŭ kapron) per la interesa proteino (tio estas, injektante la proteinon en la korpon de la besto). Oni elprenas poste la antikorpojn, kiujn la besto produktis kontraŭ tiu proteino. Kelkajn sampraulajn antikorpojn (monoclonal), kies afineco estas pli alta, ankaŭ oni povas uzi por proteina trimoo.
Dua antikorpo redakti
Oni poste rincas la membranon por forigi la unue uzitajn antikorpojn ne ligitajn, kaj oni inkubacias la membranon kun duaj antikorpoj. Tiuj antikorpoj ligiĝas al la unuaj (ili kutime estas produktitaj de malsamaj bestoj). Tiuj duaj antikorpoj estas kutime kuplitaj kun enzimo por ebligi vidan identigon de la interesa proteino ĉe la membrano. Kiam oni aldonas la substraton de la enzimo, tio rezultas el kolora reakcio videbla sur la membrano. Alternativo al uzo de enzimo kuplita al dua antikorpo estas uzo de radioaktiva etikedo.
Rezultoj redakti
La duajn antikorpojn ne ligitajn, oni forigas kaj la substraton de la enzimo, oni inkubacias kun la membrano. Se radioaktiva etikedo estas uzata, oni metas memradiografian filmon sur la membranon. La korespondaj strekoj aperos sur la rivelita filmo (per pli malhelaj regionoj). Tiel, la unua antikorpo identigas specife la interesan proteinon, kaj la dua antikorpo identigas specife la unuan antikorpon, makulo aperanta ĉe la membrano karakterizas la pozicion de la interesa proteino. Tiujn proksimumojn pri grandeco oni povas fari komparante la strekojn obtenitajn al tiu de pezmarkilo. Kutime, eĉ post spongo, la ĝelo ne estas komplete senigita je proteinoj.
Principe, eblus ligi la kemian signalon rekte al la unua antikorpo, sed la produkto de antikorpo pli facilas se ambaŭ funkcioj pri specifa rekono kaj de signalizo estas disigitaj.
Medicinaj aplikebloj redakti
- Testoj pri aidoso
- Detekto de la freneza bovin-malsano (bovina spongoforma encefalito)