Gen-silentigo
Historio de malkovro
redaktiLa uzado de transgenaj plantoj ebligis malkovron, komence de la 90aj jaroj, de ne antaŭsuspektitaj mekanismoj (kaj tiam ne klarigitaj) pri genesprim-estingiĝo. Fakte, tiu senesprimiĝo observiĝis uzante transgenan konstruaĵon kiu celis super-esprimon de interesa geno!! Kiel super-esprimo prov-atingota povas finatingi estingon de la transgena esprimiĝo kaj de la homologa gen-kopio jam ĉeestanta en la ĉelo? Aŭ, pli triviale, kiel 1+1=0? Tiam ŝajnis ke la artefarita aldono en ĉelon de pliaj gen-kopioj blokis ĉiajn esprimojn de la malsamaj kopioj de tiu geno. Poste, estis demonstrita ke tiuj fenomenoj okazis je posttransskriba nivelo kaj devenis de la specifa difekto de homologaj mRNA devenantaj el ĉel-devena geno kaj el la transgeno. La studado de tiuj fenomenoj, nomitaj PTGS (Post-Transskriba GenSilentigo) demonstris la implikon de dufadena RNA (dfRNA). Ties formiĝo rezultas, laŭkaze, el la ĉeesto de inversitaj ripetiĝoj ĉe la transgena lokuso kondukantaj al la transskribado de mRNA « signif-direkta/sensignif-direkta », aŭ de la forta produktado de transskribitoj « signif-direktaj » per mekanismoj ankoraŭ ne klarigitaj. Krome, en 1998, estis demonstrita ĉe la nematodo Caenorhabditis elegans ke la injekto de dfRNA induktis senaktivigon de ĉel-devenaj homologaj genoj. Tiu fenomeno, nomita RNA interfero (kaj la RNA respondecantaj pri tio estas nomitaj interfera RNA aŭ iRNA), tre rapide montris multe da similaĵoj kompare kun PTGS:
- interveno de dfRNA en senaktivigo de genesprimiĝo
- simileco inter pluraj proteinoj kontrolantaj la fenomenon
- akumulado de etaj RNA inter 21 kaj 25 nukleotidojn signif-direktaj aŭ sensignif-direktaj, homologaj al mRNA el la silentigita geno
- propago de senaktiviga signalo kiu, ekde loka komenco, kelkfoje induktas silentigon en la tuta organismo per tutsistema reago.
Kiel funkcias gen-silentigo?
redaktiLa implikataj mekanismoj en la PTGS- kaj iRNA- fenomenoj havas komune nombrajn etapojn. Tiuj fenomenoj pri PTGS/iRNA ŝajnas ankaŭ ekzisti ĉe filamentaj fungoj (kiel Neurospora crassa), ĉe la insektoj (drozofilo) kaj mamuloj. Ekfunkciigo de PTGS estas provokita de ĉeesto de dfRNA farita laŭ la sinsekvo de la interesa geno. Tiuj dufadenaj molekuloj estas produktataj ekde transgeno aŭ direkte injektitaj en la ĉelon. Tiuj dfRNA tiam estas digestataj en oligonukleotidojn je 20 nukleotid-paroj, nomitaj eiRNA (etaj interferaj RNA, angle siRNA ), de RNazo specifa por dufadenaj RNA (nomita dajcero ĉe animaloj). La sensignif-direktaj eiRNAoj el tiu tranĉado servas kiel gvidilo al enzima komplekso (RNA-Induktita Silentiga Komplekso aŭ RISK) kiu difektas la mRNA devenantan el la ĉel-devena geno. Tiu transskribitoj-malaperigo blokas tiam la tradukadon de la korespondanta proteino. Krome, ĉe C. Elegans, estis demonstrita ke sensignif-direkta eiRNA povas servi kiel prajmiloj al RNA-dependa RNA-polimerazo (RdRP) por la sintezo de komplementaj RNA ekde la mRNA de la originala geno, pliriĉigante tiel la ĉelon je dfRNA kaj amplifante tiel la iRNA-signalon.
PTGS-fenomeno uzata kiel gen-esprim-malŝaltilo
redaktiOni povas uzi la iRNA-fenomenon kiel gen-silentigan teknikon relative facile uzebla, bona alternativo al gen-senaktivigo per homologa rekombiniĝo kiu daŭre validas sed nur ĉe tre malmultaj specioj. Ĉe C. Elegans, sufiĉas nutri tiujn bestojn per bakterioj enhavantaj dfRNA el interesa geno por bloki, portempe kaj preskaŭ ĉiufoje, la esprimiĝon de tiu geno en preskaŭ ĉiuj ĉeloj de la vermo. Ĉe la mamuloj, ĉeesto de dfRNA en la ĉelo induktas kutime kontraŭvirusajn respondojn sekvigantaj ĝeneralan inhibadon de tradukado en la ĉeloj. Tial unuaj uz-provoj de iRNA ĝenerale fiaskis. Nur la ĉeloj aŭ histoj sen tiaj reagoj (unuĉelaj zigotoj, kulturo de ne-diferenciĝintaj ĉeloj) reagis pozitive al iRNA. Tamen, antaŭ nelonge, oni sukcesis ĉirkaŭiri tiun obstaklon limigante la dfRNA-longecon je 21 nukleotidoj kun bone determinintaj strukturoj kiuj kapablas provoki iRNA-fenomenon sen indukti kontraŭvirusan reagon.
Helpo kiun ofertas gen-silentigaj teknikoj en esplorado
redaktiNune, la uzado de PTGS/iRNA-fenomenoj troviĝas strategi-meze de gravaj disvolvaj esploradoj. Ĉe iuj bestoj (precipe C. Elegans kaj drozofilo), simpleco de la dfRNA-injekta metodo ebligis ties aplikadon en genomaj studoj, celantaj samptempe kaj geno-post-gene, funkci-komprenon de genoj portitaj de tuta kromosomo (ĉirkaŭ 2500 genoj). Ĉe mamuloj, samtipaj studoj estas nun antaŭviditaj per ĉelkulturo.
Ĉe plantoj, oni disvolvis transgenajn organismojn fabrikitajn tiel ke iuj genoj transskribiĝu rekte en dfRNAon (vidu figuron 2). Tiuj transgenaj konstruaĵoj estas tre efikaj por senaktivigi la homologajn ĉel-devenajn genojn kaj tiel produkti transgenajn plantojn kun modifitaj fenotipoj kiuj povas havi agrikulturan intereson. Krome, la plej alta transform-efikeco observita ĉe la planto Arabidopsis thaliana permesas antaŭvidi aplikeblon de tiuj strategioj al genomikaj studoj.